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白細胞分類計數參考方法
Reference leukocyte differential count method
前 言
為了保證白細胞分類計數結果具有溯源性和準確性，特制定本標準。
本標準修改采用了美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒發的《白細胞分類計數參考方法和儀器評價方法》標準（H20-A）。
本標準從20XX年XX月XX日起實施。
本標準的附錄A、附錄B和附錄C都是規范性附錄。
本標準由衛生部醫政司提出。
本標準由上海市臨床檢驗中心負責起草。
本標準主要起草人：胡曉波、許蕾、宋穎、方心馳、張錦鋒。 本標準由衛生部委托衛生部臨床檢驗中心負責解釋。
1 范圍
本標準規定了建立白細胞分類計數參考方法中有關樣本采集、血涂片制備的要求、血涂片染色、血涂片有核細胞檢查的步驟、對檢驗人員的要求和考核等內容。
本標準適用于建立的實驗室
2 總則
2.1 本標準采用手工目視顯微鏡計數法作為白細胞分類計數的參考方法。
2.2 為了保證參考方法檢測結果的精密度和準確性，建立參考方法的實驗室必須進行比對。
3 方法
3.1 樣本采集
將靜脈血采集于EDTA－K2抗凝劑（液體或粉末狀）中（濃度為每毫升血液含1.5～2.2mg EDTA－K2·H2O）。采血后立即混勻，應拒絕分析有肉眼可見凝塊的樣本。
3.2 血涂片制備和要求
3.2.1 血涂片制備
3.2.1.1 每份樣本制作3張血涂片。要求所用玻片清潔、干燥、無塵，大小為25 mm×75mm，厚度為0.8～1.2mm。并有明確標記。如果樣本中白細胞數量少時，需要制備更多血涂片（如6張）。
3.2.1.2 使用EDTA－K2抗凝血液樣本時，應在采集后4小時內制備血涂片。在制片前，樣本應充分混勻。注意，樣本不能冷藏。
3.2.1.3 用楔形技術制備血涂片。在玻片近一端1/3處，加一滴（約0.05ml）充分混勻的血液，握住另一張較狹窄的、邊緣光滑的推片，以30º～45º角使血滴沿推片迅速散開，快速、平穩地推動推片至玻片的另一端（見圖1）。
3.2.1.4 在1小時內，用Romanowsky類型染液染色；或在1小時內，用無水甲醇（含水量﹤3%）固定后染色。
3.2.2 良好血涂片的要求
3.2.2.1 血膜至少長25mm，至玻片兩側邊緣的距離至少為5mm。
3.2.2.2 血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。
3.2.2.3 血細胞從厚區到薄區逐步均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。
3.2.2.4 血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。所有這些情況會使白細胞集中在這些區域內。
3.2.2.5 在鏡檢區域內，白細胞形態應無人為異常改變。通常，隨著保存時間的延長，抗凝血會造成白細胞形態的改變，如胞漿內形成空泡，核分解破裂等。應將抗凝血液保存時間的影響減小到zui低限度。除部分淋巴細胞增生性疾病外，鏡檢區域內破損白細胞量應<2％。
3.2.2.6 無人為污染。
3.3 血涂片染色
采用Romanowsky類染料染色。Romanowsky類染料由亞甲藍和/或亞甲藍氧化產物（天青B），和鹵化熒光素（通常為伊紅B或Y）組成。良好的染色能準確鑒別成熟和未成熟白細胞或異常細胞。
3.3.1 染料的性能
Romanowsky類染料的質量直接影響染色效果。在pH6.4～7.0條件下，染料與細胞中特定成分（細胞核和細胞漿特殊顆粒）相互作用，產生典型的顏色，如細胞核染深紫色，紅細胞染鮮亮的橙紅色。
3.3.2 可接受的染色qing況
粒細胞、單核細胞、淋巴細胞和其他細胞必須能顯示清晰的核漿分界，能識別核染色質成分和細胞漿的顏色差異。
3.4 需分類的外周血有核細胞
外周血可見多種有核細胞。常見的有：中性分葉核粒細胞、中性桿狀核粒細胞、淋巴細胞、異型淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。外周血中正常白細胞的形態描述見附錄A。 外周血中少見的其他有核細胞在專業的血液學教科書和圖譜中均有描述，本標準中不再敘述。
3.5 血涂片檢查步驟
3.5.1 血涂片顯微鏡檢查
3.5.1.1 首先在低倍鏡下（10倍～40倍）進行瀏覽，觀察有無異常細胞和細胞分布情況。然后，在100倍油鏡下，觀察細胞漿內的顆粒和核分葉情況。
3.5.1.2 檢查從約50％的紅細胞互相重疊區域開始，向紅細胞*散開的區域推移。血涂片較薄的區域，呈羽毛狀，為“血片邊緣”。
3.5.1.3 中性粒細胞，單核細胞和淋巴細胞分布均勻的區域為血涂片分類“可接受”區域。當白細胞總數正常時，在血涂片尾部和邊緣，每油鏡視野所見的白細胞數量不超過血涂片體部的2～3倍。
3.5.1.4 除某些病理情況（如慢性淋巴細胞白血病）外，破碎細胞或不能識別細胞的數量不超過白細胞總數的2%。若破碎細胞仍能明確鑒別（如破碎的嗜酸性粒細胞）應包括在分類計數中。在結果報告中，應設其他欄，以備填寫破碎細胞或不能識別細胞，并作適當描述。
3.5.2 計數方法
3.5.2.1 采用“城垛式”方法檢查血涂片（圖1）。每個明確識別的細胞必須歸入下列分類中：中性分葉核粒細胞；中性桿狀核粒細胞；淋巴細胞；異型淋巴細胞；單核細胞；嗜酸性粒細胞；嗜堿性粒細胞；其他有核細胞（除有核紅細胞外）。能明確識別的破碎細胞，應恰當分類。
3.5.2.2 每張血涂片應計數200個白細胞，若樣本中白細胞數量減少，應增加檢查血涂片的數量。
3.5.2.3 白細胞分類結果以百分率和值表示。
3.5.2.4 計數所有的有核紅細胞，結果以每100個白細胞計數中見到幾個表示。
3.6 檢驗人員要求和考核
3.6.1 檢驗人員的要求
3.6.1.1 檢驗人員的經驗
檢驗人員必須能對所有常見白細胞進行分類，并了解大多數白細胞的形態異常，包括先天性和獲得性。參與細胞形態學檢查的檢驗人員必須進行專業培訓，并具備實際工作經驗。
3.6.1.2 檢驗人員的態度
檢驗人員的工作態度、動機和專心程度是關鍵因素。因為白細胞分類計數是一項主觀性很強的工作，影響分類計數的因素很多，有檢驗人員的態度、實驗室環境條件和工作量等。對于以每張血涂片計數200個白細胞的參考方法工作量來說，每天每個檢驗人員血涂片檢驗數量約為15～25張。
3.6.2 血涂片考核
3.6.2.1 考核樣本
選擇10份樣本。樣本必須包含7種類型白細胞（中性分葉核粒細胞、中性桿狀核粒細胞、淋巴細胞、異型淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）。其中，至少有一份樣本含有少量有核紅細胞，一份含有少量未成熟白細胞。
按照3.2要求，每份樣本制備5張血涂片，按照第3.3節所述方法染色，統一標簽，但檢驗人員不知道樣本來源。玻片分成5套，每套包含10份樣本的玻片各1張。
3.6.2.2 檢驗人員考核
分發給參加檢驗的人員一套考核血涂片，要求每張血涂片做200個白細胞的分類計數，并根據血涂片編號，報告結果，交給監考人。監考人計算每份樣本每種細胞的均值，進行結果解釋，制作每種類型細胞分布圖。其中橫坐標（X軸）為組均值（百分率），組均值為實驗室具備資格的檢驗人員計數的均值。縱坐標（Y軸）代表檢驗人員個體的結果。在圖上添加兩條代表理論上95％和99％可信區間的線條，由計數百分率的標準誤算得，計算公式見附錄B。
3.6.2.3 解釋
根據Gaussian分布假說，5％的個體結果可能會超出95％范圍，但不會超出99％的限值。
若數據不符合該規則，表示存在樣本處理過程或操作錯誤（如樣本標簽錯誤，制片不佳，讀片區域不當或細胞分類錯誤）。在分析出可能誤差來源后，必須重新進行考核。若不能符合統計學規則，應高度懷疑結果的有效性。
監考人必須仔細地檢查每張圖形。檢驗人員數值應該呈隨機分布。若非如此，評價中可能引入了檢驗人員的偏倚。應該采取糾正措施（如培訓或更換人員等），并重新進行考核。
應保留一套考核血涂片作為標準片，用于其他檢驗人員的培訓和考核。
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