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流式細胞儀的使用一般分為三個步驟。，是儀器前階段，包括試劑的準備，細胞制備、細胞的熒光染色；第二，是流式細胞儀階段，主要是儀器的操作；第三，是結(jié)果分析階段。

淋巴細胞外周血的白細胞

FACS緩沖液PBS疊氮鈉溶液儀器緩沖液FACS清潔液FACS洗凈液

流式細胞儀

一、 細胞和試劑的準備

1.  細胞樣品：來源淋巴細胞或外周血的白細胞。

2.  熒光標記單克隆抗體：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）標記的單克隆抗體。

3.  封閉抗體：抗Fc受體抗體

4.  FACS緩沖液：

1×PBS  950 ml

FCS  40 ml

10%疊氮鈉溶液  10 ml

5.  儀器緩沖液（FACS-flow）：儀器廠家提供

6.  FACS清潔液（FACS clean ）和FACS洗凈液（FACS rinse）：儀器廠家提供。

二、操作步驟
 

1.  單細胞懸液的制備：將1×10⁵~1×10⁷的細胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘，棄上清；加入FACS緩沖液100 μl 懸浮細胞。

2.  封閉細胞表面Fc受體：在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分鐘。

3.  細胞與熒光抗體結(jié)合：在步驟2中加入熒光抗體1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分鐘。

4.  洗細胞去除游離的熒光抗體：在步驟3中加入FACS緩沖液350 μl，輕輕混勻，3000 r/min，離心5分鐘，棄上清，重復(fù)步驟（4）2次。

5.  上樣前處理：取100 μl 儀器緩沖液加入步驟（4）獲得的細胞沉淀中，輕輕混勻懸浮細胞，將細胞懸液移入FACS管中，準備進行儀器檢測和分析。

三、儀器的操作

以FACSCaliburTM（BD Biosciences）儀器為例。儀器主要分為主機部分（包括激光激活源，射流，射線探測器）和計算機部分（CELLQuest softwere）。儀器的操作分為使用前的準備、使用中的操作和使用后的清洗。

1.使用前的準備

（1）打開電源：包括系統(tǒng)電源和主機部分電源。

（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應(yīng)含足夠的儀器緩沖液，廢液槽應(yīng)在上次使用后清洗干凈。

（3）使機器處于負亞狀態(tài)，才能使細胞懸液被吸入至機器的吸管口。

（4）機器處于可應(yīng)用狀態(tài)時，指示燈會變成綠色。

2.使用中的操作

（1） 計算機部分—使用CELLQuest程序系統(tǒng)軟件：

①設(shè)定所要檢測細胞的數(shù)量：一般設(shè)10 000~20 000個細胞。

②命名本次實驗：一般含使用者的姓名和實驗日期。

③打開記數(shù)部分：顯示進入的細胞數(shù)以及檢測一定量的細胞所需要的時間。

④將微機與主機連接：控制檢測時的預(yù)檢測和實際檢測。

⑤主機設(shè)定：一般是已設(shè)定好的適合測定淋巴細胞的條件，包括探測器的電壓。探測器的電壓是調(diào)空光電倍增管所能檢測熒光密度的范圍。

⑥選擇檢測的波長和表達方式（plot）：如果用一種熒光抗體，一般選直方圖（histogram）；如果用兩種熒光抗體，常選點狀二維圖（dot plot）或輪廓線圖（contour plot）表

 CD69分子表達檢測直方圖的數(shù)值說明
 

b.abti-CD3（2 ng/ml）檢測結(jié)果
 

c.abti-CD3（10 ng/ml）檢測結(jié)果
 

CD4及CD8細胞點狀二維圖結(jié)果
 

不同的熒光物要求選擇不同的激發(fā)波長，參見下表
 

（2）細胞的吸入：將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管孔處。

先預(yù)檢測樣品，然后進行實際檢測。可根據(jù)細胞的濃度選擇測定的速度（低、中或高）。所有的數(shù)據(jù)將自動存入微機。

3.使用后的清洗  所有樣品測定完后，要進行儀器的清洗。

（1）將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入1分鐘。

（2）將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入 1分鐘。

（3）再將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。

（4）同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。

（5）后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔后，關(guān)閉機器。

（6）將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。

1.  減少非特異熒光染色

（1）細胞的活性和狀態(tài)：流式細胞儀不但可探測細胞表面的熒光，也可探測細胞內(nèi)的熒光。因此，如果要檢測細胞表面的分子，一定要保證細胞的活性，還應(yīng)盡可能保持細胞靜止，通常在4度進行操作。否則，熒光抗體進入死細胞內(nèi)，會產(chǎn)生非特異結(jié)果。

（2）封閉抗體的應(yīng)用是*的，因為大多數(shù)的免疫細胞表面都表達有Fc-R。細胞與抗體相互作用后，一定要用FACS緩沖液洗2~3次，以除去游離的抗體。

2.  單染色時以FACS常用，F(xiàn)ITC標記抗體熒光比較穩(wěn)定而且價格合適。

3.  如果同時要檢測兩種以上的分子，一定要選擇不同波長的熒光所標記的抗體。