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雙向電泳樣品制備程序
  • 發(fā)布日期:2018-07-02      瀏覽次數(shù):2206
    • 一、培養(yǎng)細(xì)胞(culture cell)樣品處理方法:

      培養(yǎng)動(dòng)物組織細(xì)胞由于沒(méi)有細(xì)胞壁,因此可以將細(xì)胞收集下來(lái),直接加入裂解緩沖液(Lysis buffer)抽提總蛋白。裂解緩沖液有多種配方,本實(shí)驗(yàn)室主要采用如下成份:

      1. 7M Urea,2M Thiourea,4%(w/v)CHAPS,40mM Tris-Base,40mM DTT,2% Pharmalyte pH 3-10.

      其他常用的裂解緩沖液如下:

      2. 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

      3. 加入 0.3-1% SDS 在 95 C 煮樣品 5mins,冷卻后加入至少 5倍體積的(A)或(B)裂解液。

      總蛋白抽提程序:

      1. 培養(yǎng)細(xì)胞的收集;

      2. 用磷酸緩沖液(PBS)洗細(xì)胞 3 次(室溫,1000g,各 2min);

      3. 將細(xì)胞分裝到 1.5ml Eppendof管中,吸干殘留的 PBS;

      5. 4 C,40,000g,離心 1h;

      6. 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白,然后分裝至 Eppendof 管里保存在-78℃?zhèn)溆谩?/p>

      二、組織樣品處理方法:

      對(duì)大多數(shù)從動(dòng)物或植物組織里提取總蛋白質(zhì)而言,同樣沒(méi)有一種通用的程序。但遵循的原則基本相同。下面列出一種對(duì)植物樹(shù)葉總蛋白的方法。

      三氯醋酸-丙酮沉淀法(TCA/acetone precipitation)提取植物樹(shù)葉總蛋白程序:

      1. 在液氮中研碎葉片;

      2.  懸浮于含 10%三氯醋酸(TCA)和 0.07%β-巰基乙醇(可用 DTT替代)的丙酮溶液在-20℃  的冰浴;

      3. 讓蛋白質(zhì)沉淀過(guò)夜然后離心(4 C,40,000g, 1h),棄上清;

      4. 重懸沉淀浮于含 0.07%β-巰基乙醇的冰預(yù)冷丙酮溶液里;

      5. 離心(4 C,40,000g, 1h)后真空干燥沉淀;

      6. 用(A)或(B)裂解液溶解沉淀,離心(4 C,40,000g, 1h)。

      7. Brandford 法定量蛋白,然后分裝至 Eppendof 管里保存在-78℃?zhèn)溆谩?/p>

      超速離心法:

      1. 取材;

      2. 用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末,每1g樣品加入0.5ml裂解液,使用組織勻漿器勻漿30 s;

      3. 組織懸液15℃,10 000× g離心10 min;

      4. 上清液4℃,150 000× g超速離心45 min;

      5. 小心避開(kāi)上層漂浮的脂質(zhì)層,吸取離心上清6℃ 40,000g再次離心50 min;

      6. 取離心上清。Bradford法定量,分裝后置-75℃保存。

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