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CRISPR技術(shù)再升級(jí)——單堿基的編輯
  • 發(fā)布日期:2018-08-08      瀏覽次數(shù):2712
    • 導(dǎo)讀

      美國(guó)哈佛大學(xué)David R. Liu課題組創(chuàng)新性的開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的單堿基編輯器(base editor, BE),有效地解決了修復(fù)致病基因點(diǎn)突變難題。

      CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)來(lái)源于簡(jiǎn)單的細(xì)菌免疫系統(tǒng)組分,經(jīng)過(guò)改造后可在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯。該系統(tǒng)是單RNA(single-guide RNA, sgRNA) 介導(dǎo)的核酸酶系統(tǒng),通過(guò)靶點(diǎn)特異的CRISPR RNA (crRNA)序列與靶序列進(jìn)行堿基配對(duì)從而引導(dǎo)Cas9蛋白至特定的切割位點(diǎn)進(jìn)行切割,然后通過(guò)經(jīng)典的非同源性末端接合 (NHEJ) 或同源重組 (HDR) 對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。然而,NHEJ修復(fù)會(huì)造成核酸的插入或者缺失(Indel), 產(chǎn)生顯性負(fù)效應(yīng)突變或者新抗原表位的風(fēng)險(xiǎn)。雖然HDR修復(fù)度高,然而HDR修復(fù)效率極低且局限于有絲分裂細(xì)胞,限制了HDR修復(fù)的應(yīng)用。因此,修復(fù)致病基因點(diǎn)突變依然是一大難題。

       

      美國(guó)哈佛大學(xué)David R. Liu課題組發(fā)表在《Nature》的” Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”論文創(chuàng)新性的開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的單堿基編輯器(base editor, BE),有效地解決了上述問(wèn)題。

      該研究組將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║)的大鼠胞嘧啶核苷脫氨酶rAPOBEC1通過(guò)linker序列XTEN連接到催化失活Cas9(catalytically dead Cas9, dCas9)N端,構(gòu)建出了代單堿基編輯器base editor (BE1)(rAPOBEC1–XTEN–dCas9)(圖一)。

      圖一

      運(yùn)用BE1進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)表明目標(biāo)C堿基5端是G堿基時(shí)編輯效率顯著降低,BEI編輯效率遵循TC ≥ CC ≥ AC > GC (C為目標(biāo)堿基)原則,此外目標(biāo)C堿基位于sgRNA的第7位或者附近時(shí)編輯效率高(圖二)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明,運(yùn)用BE1可以使C→T的編輯效率達(dá)到0.8% - 7.7%(圖三)。

      圖二

      鑒于BE1的單堿基編輯效率較低,研究者們認(rèn)為有可能是BE1編輯使CG堿基對(duì)轉(zhuǎn)換成UG堿基對(duì),然而正常細(xì)胞會(huì)將UG識(shí)別為錯(cuò)配堿基對(duì),從而啟動(dòng)體內(nèi)尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase, UDG)識(shí)別U并將其切除,進(jìn)而將其重新修復(fù)為CG。因此在BE1的基礎(chǔ)上,研究者們又融合了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(UGI),構(gòu)建出了第二代單堿基編輯器BE2(rAPOBEC1–XTEN–dCas9-UGI)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BE2編輯效率是BE1的3倍(圖三)。

      BE2編輯過(guò)程中只改變了CG堿基對(duì)中的C堿,因此其理論上C→T的大轉(zhuǎn)換效率只能達(dá)到50%。為了進(jìn)一步提高編輯效率,研究者們部分恢復(fù)BE2編輯器中Cas9的切割活性(dCas9-(A840H)),構(gòu)建出了第三代單堿基編輯器BE3(rAPOBEC–XTEN–dCas9(A840H)–UGI)。BE3中的Cas9可以切割包含G堿基的非編輯DNA單鏈,斷裂后的非編輯鏈(G所在鏈)會(huì)以編輯鏈(T所在鏈)為修復(fù)模板進(jìn)行修復(fù),因此理論上C→T的轉(zhuǎn)換效率可以達(dá)到100%,即CG可以*轉(zhuǎn)換為TA。研究結(jié)果表明BE3編輯效率是BE1的2-6倍(圖三)。

       

      圖三

      后,研究者們運(yùn)用BE3對(duì)致病突變修復(fù)進(jìn)行了研究。在體外細(xì)胞系的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BE3對(duì)阿爾茨海默病致病基因APOE4的改造效率可以高達(dá)74.9%,對(duì)癌癥相關(guān)致病基因TP53的改造效率為7.6%,而indel率維持在較低水平(4.6%及0.7%)(圖四)。

      BE3單堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)為真正意義上的單堿基(T→C, A→G)致病突變基因的修復(fù)提供可能。

       

      圖四

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