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來自德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心，QBRC、BICF中心主任謝陽教授實(shí)驗(yàn)室在QB期刊上發(fā)表關(guān)于分析MeRIP-Seq （methylated RNA immunoprecipitation sequencing）數(shù)據(jù)的新方法（A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data）。
在《A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data》這篇文章中，我們提出用一種貝葉斯統(tǒng)計(jì)模型，即貝葉斯層次模型BaySeqPeak，用于分析MeRIP-Seq數(shù)據(jù)，從而幫助研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組中的甲基化位點(diǎn)信號(hào)[1]。
RNA甲基化數(shù)據(jù)分析現(xiàn)狀
DNA與組蛋白的表觀遺傳修飾在調(diào)控基因表達(dá)上的重要影響已為科學(xué)界所廣泛熟知。同DNA一樣，作為生物遺傳信息傳遞中的重要一環(huán)，RNA分子也廣泛存在著化學(xué)修飾。目前，科學(xué)家已經(jīng)鑒定確認(rèn)了超過100種的RNA化學(xué)修飾方式，其中以m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）為常見[2]。
圖1 m6A甲基化修飾過程
m6A甲基化修飾是一種由多種蛋白參與的動(dòng)態(tài)可逆的修飾方式。它的生成主要是由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體介導(dǎo)，其中包含METTL3，METTL14和WTAP；而擦除甲基化修飾基團(tuán)的過程則由去甲基化酶FTO和ALKBH5負(fù)責(zé)。此外，多種蛋白，如YTHDF1和YTHDF3都可識(shí)別m6A信號(hào)位點(diǎn)，并通過結(jié)合下游效應(yīng)蛋白的方式傳遞甲基化信號(hào)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，m6A在調(diào)控基因表達(dá)、剪接、RNA 編輯、RNA 穩(wěn)定性和控制mRNA壽命和降解等多方面都存在重要的影響[3]。
雖然RNA甲基化在上世紀(jì)七十年代就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)證實(shí)，但長(zhǎng)期以來由于技術(shù)局限，相關(guān)的修飾機(jī)理、調(diào)控手段以及生物學(xué)意義一直未能闡明。現(xiàn)在，MeRIP-Seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing)技術(shù)的出現(xiàn)[4,5]（圖2），使得通過高通量手段在全轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）水平上研究m6A甲基化修飾變?yōu)榭赡堋?br />
圖2 MeRIP-Seq技術(shù)流程圖
通行的分析MeRIP-Seq數(shù)據(jù)的思路是，利用一個(gè)特定長(zhǎng)度的（通常為100～200nt長(zhǎng)）窗口從前至后掃描整條染色體，并記錄每個(gè)樣本落入每個(gè)窗口中的RNA短序列數(shù)目（read count）。通常，實(shí)驗(yàn)條件下（IP）樣本的RNA短序列應(yīng)大致分布在甲基化位點(diǎn)附近，而對(duì)照條件下（INPUT）則和正常的每個(gè)基因的表達(dá)值正相關(guān)（沒有甲基化影響）。這一數(shù)據(jù)特點(diǎn)使得傳統(tǒng)分析DNA甲基化的工具無法很好地勝任RNA甲基化數(shù)據(jù)的分析。總而言之，轉(zhuǎn)化為統(tǒng)計(jì)語言就是，我們需要尋找那些在實(shí)驗(yàn)條件下序列數(shù)目顯著高于對(duì)照條件下序列數(shù)目的窗口（甲基化位點(diǎn)），并相應(yīng)地給予顯著性統(tǒng)計(jì)值（p值或假陽性概率）。
BaySeqPeak模型分析RNA甲基化數(shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)
我們建立的BaySeqPeak模型則主要從MeRIP-Seq數(shù)據(jù)的重復(fù)樣本數(shù)少，樣本數(shù)據(jù)空間上前后相關(guān)，以及存在大量零數(shù)據(jù)的特點(diǎn)出發(fā)，利用以下三種不同的策略解決了這些難題：
1）采用零膨脹的負(fù)二項(xiàng)分布擬合單樣本的序列計(jì)數(shù)，以防止大量零數(shù)據(jù)和過度離散破壞模型穩(wěn)定性；
2）采用隱馬爾可夫模型模擬單樣本空間上的前后相關(guān)性；
3）利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)的思路，使得模型在低樣本數(shù)的條件下依然維持足夠的準(zhǔn)確度。
在模擬數(shù)據(jù)中，BaySeqPeak能很好地預(yù)測(cè)了實(shí)驗(yàn)人員預(yù)先設(shè)定的甲基化位點(diǎn)，而比較的exomePeak和MeTPeak模型則匯報(bào)了較多的假陽性和假陰性位點(diǎn)（圖3）。
圖3 模擬數(shù)據(jù)中真實(shí)的甲基化位點(diǎn)與各模型預(yù)測(cè)的甲基化位點(diǎn)（紅色）
通過ROC曲線可以發(fā)現(xiàn)，不同參數(shù)下的模擬數(shù)據(jù)中，BaySeqPeak模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性均顯著高于exomePeak和MetPeak模型（圖4）。
圖4 不同參數(shù)條件下，各模型預(yù)測(cè)的ROC曲線
在數(shù)值收斂方面，模型在經(jīng)過多次迭代之后，預(yù)測(cè)值已穩(wěn)定地收斂到了真實(shí)值附近（圖5）。
圖5 甲基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)數(shù)的收斂過程
在真實(shí)數(shù)據(jù)中，BaySeqPeak模型也很好地預(yù)測(cè)了甲基化的區(qū)段。不僅如此，相較于exomePeak，BaySeqPeak還詳細(xì)區(qū)分出了一個(gè)甲基化區(qū)域中臨近的幾個(gè)甲基化峰位，顯示了模型的高精度與高分辨率。
圖6 一個(gè)真實(shí)數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)的甲基化區(qū)域
RNA甲基化的研究目前仍然處于起步階段，修飾調(diào)控過程的具體細(xì)節(jié)，以及這些修飾如何具體地影響細(xì)胞的功能，特別是在疾病條件下，這些化學(xué)修飾是如何發(fā)生變化的仍然存在大量未知。本文提出的統(tǒng)計(jì)方法為有效準(zhǔn)確地分析m6A甲基化數(shù)據(jù)提供了可能，我們期待在未來RNA甲基化的研究中能夠在此模型基礎(chǔ)上再推進(jìn)一步。
參考文獻(xiàn)
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